Hemoqlobin Elektroforez Təcrübəsi

Təcrübə prinsipi

Hemoqlobin elektroforezi müxtəlif normal və anormal hemoglobinləri aşkar etmək və təsdiqləmək məqsədi daşıyır.

Müxtəlif hemoglobin tiplərinin müxtəlif yükləri və izoelektrik nöqtələri səbəbindən müəyyən pH tampon məhlulunda hemoglobinin izoelektrik nöqtəsi bufer məhlulunun pH-dan aşağı olduqda, hemoglobin mənfi yük daşıyır və elektroforez zamanı anoda doğru miqrasiya edir. Əksinə, müsbət yüklü hemoglobin katoda doğru hərəkət edir.

Müəyyən bir gərginlik altında və müəyyən bir elektroforez müddətindən sonra müxtəlif yüklərə və molekulyar çəkilərə malik olan hemoglobinlər fərqli miqrasiya istiqamətləri və sürətləri nümayiş etdirirlər. Bu, fərqli zonaların ayrılmasına imkan verir və müxtəlif hemoglobinlərin miqdarını təyin etmək üçün bu zonalarda sonrakı kolorimetrik və ya elektroforetik skan təhlili aparıla bilər. Ən çox istifadə edilən üsul pH 8.6 sellüloza asetat membran elektroforezidir.

Sitoplazma daxilində qlikogen və ya polisaxarid maddələrdə (məsələn, mukopolisakkaridlər, mukoproteinlər, qlikoproteinlər, qlikolipidlər və s.) mövcud olan etilen qlikol qrupları (CHOH-CHOH) dövri turşu ilə oksidləşir və aldehid qruplarına (CHO-CHO) çevrilir. Bu aldehid qrupları rəngsiz bənövşəyi-qırmızı Schiff reagenti ilə birləşərək, polisaxaridlərin hüceyrədə mövcud olduğu yerlərdə çökən bənövşəyi-qırmızı boya əmələ gətirir. Bu reaksiya əvvəllər glikogenlə boyanma adlanan dövri turşu-Schiff (PAS) boyaması kimi tanınır.

Təcrübə üsulu

Materiallar:Sellüloza asetatmembrane, elektroforez aparatı(DYCP-38C və enerji təchizatı DYY-6C), Üstün Nümunə Yükləmə Aləti(pipet), spektrofotometr, kolorimetrik kyuvetlər, tamponlar.

Bufer:

(1) pH 8,6 TEB Bufer: 10,29 q Tris, 0,6 q EDTA, 3,2 q bor turşusu çəkin və 1000 ml-ə distillə edilmiş su əlavə edin.

(2) Borat Buferi: 6,87 q boraks və 5,56 q bor turşusu çəkin və 1000 ml-ə distillə edilmiş su əlavə edin.

Prosedur:

PHemoqlobin məhlulunun bərpası

Antikoaqulyant kimi tərkibində heparin və ya natrium sitrat olan 3 ml qan alın. 2000 rpm-də 10 dəqiqə sentrifuqa edin və plazmanı atın. Qırmızı qan hüceyrələrini üç dəfə fizioloji salin ilə yuyun (750 rpm, hər dəfə 5 dəqiqə sentrifuqa). 2200 rpm-də 10 dəqiqə sentrifuqa edin və supernatantı atın. Bərabər miqdarda distillə edilmiş su əlavə edin, sonra 0,5 dəfə karbon tetraklorid həcmi əlavə edin. 5 dəqiqə güclü silkələyin və sonra istifadə üçün yuxarı Hb məhlulunu toplamaq üçün 2200 rpm-də 10 dəqiqə sentrifuqa edin.

Membrananın islanması

Selüloz asetat membranını 3 sm × 8 sm ölçüdə zolaqlara kəsin. Onları pH 8.6 TEB tamponunda tam doymuşa qədər isladın, sonra çıxarın və filtr kağızı ilə qurudun.

Ləkələnmə

10 μl hemoglobin məhlulunu kənardan təxminən 1,5 sm məsafədə selüloz asetat membranına (kobud tərəfi) şaquli olaraq təyin etmək üçün pipetdən istifadə edin.

Elektroforez

Borat bufer məhlulunu elektroforez kamerasına tökün. Selüloz asetat membranını xallı tərəfi kameranın katod ucuna qoyun. 200 V-da 30 dəqiqə işləyin.

Elüsyon

HbA və HbA2 zonalarını kəsin, ayrı-ayrı sınaq borularına qoyun və müvafiq olaraq 15 ml və 3 ml distillə edilmiş su əlavə edin. Hemoqlobini tamamilə çıxarmaq üçün yumşaq bir şəkildə silkələyin, sonra qarışdırın.

Kolorimetriya

Elüsyon məhlulu üçün distillə edilmiş sudan istifadə edərək absorbansı sıfırlayın və uduculuğu 415 nm-də ölçün.

Hesablama

HbA2(%) = HbA2 borusunun udulması / (HbA borusunun udulması × 5 + HbA2 borusunun udulması) × 100%

Eksperimental Nəticələrin Hesablanması

pH 8.6 TEB Bufer Sellüloza Asetat Elektroforezi üçün istinad diapazonu: HbA > 95%, HbA2 1%-3.1%

Qeydlər

Elektroforez vaxtı çox uzun olmamalıdır. Selüloz asetat membranı elektroforez zamanı qurumamalıdır. HbA və HbA2 aydın şəkildə ayrıldıqda elektroforezi dayandırın. Uzun müddətli elektroforez bandın yayılmasına və bulanıqlığına səbəb ola bilər.

Çox nümunə istifadə etməkdən çəkinin. Həddindən artıq hemoglobin mayesi bantın ayrılmasına və ya qeyri-kafi boyanmasına səbəb ola bilər ki, bu da HbA səviyyəsinin yanlış artmasına səbəb olur.

Selüloz asetat membranının zülallarla çirklənməsinin qarşısını alın.

Cərəyan çox yüksək olmamalıdır; əks halda, hemoglobin bantları ayrılmaya bilər.

Həmişə normal şəxslərdən nümunələri və lazımi məlum anormal hemoglobinləri nəzarət kimi daxil edin.

Beijing Liuyi Biotechnology modeli olan hemoglobin elektroforezi üçün peşəkar elektroforez tankı istehsal edir.DYCP-38Csellüloza asetat membran elektroforez tankı və sellüloza asetat membran elektroforez çəni üçün iki elektroforez enerji təchizatı modeli mövcuddurDYY-2CvəDYY-6Cenerji təchizatı.

Bu vaxt, Pekin Liuyi Biotexnologiyası müştərilər üçün selüloz asetat membranı təmin edir və sellüloza asetat membranının ölçüsü fərdiləşdirilə bilər. Nümunələr və əlavə məlumat üçün bizə müraciət etməyə xoş gəlmisiniz.

Beijing Liuyi brendi Çində 50 ildən çox tarixə malikdir və şirkət bütün dünyada sabit və yüksək keyfiyyətli məhsullar təqdim edə bilir. İllər boyu inkişaf yolu ilə seçiminizə layiqdir!

İndi tərəfdaşlar axtarırıq, həm OEM elektroforez tankı, həm də distribyutorlar qarşılanır.

Məhsullarımız üçün hər hansı bir satınalma planınız varsa, bizimlə əlaqə saxlamaqdan çəkinməyin. Bizə e-poçt ünvanına mesaj göndərə bilərsiniz[email protected]və ya[email protected], və ya +86 15810650221 nömrəsinə zəng edin və ya Whatsapp +86 15810650221 və ya Wechat əlavə edin: 15810650221